【文献解析-玉米|丛枝菌根真菌|lncRNA】玉米根中响应丛枝状菌根真菌定殖的lncRNA鉴定和调控网络分析

  • 2019-11-28 14:18:20
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英文题目:Identification of Long Non-Coding RNAs and the Regulatory Network Responsive to Arbuscular Mycorrhizal Fungi Colonization in Maize Roots

 

  名:International Journal of Molecular Sciences

发表时间:2019.09   IF4.18

作者单位安徽农业大学

测序产品:lncRNA转录组             

样品来源:玉米

文章类型:研究型

 

英文摘要

  Recently, long noncoding RNAs (lncRNAs) have emerged as vital regulators of many biological processes in animals and plants. However, to our knowledge no investigations on plant lncRNAs which respond to arbuscular mycorrhizal (AM) fungi have been reported thus far. In this study, maize roots colonized with AM fungus were analyzed by strand-specific RNA-Seq to identify AM fungi-responsive lncRNAs and construct an associated regulatory network. A total of 1837 differentially expressed protein coding genes (DEGs) were identified from maize roots with Rhizophagus irregularis inoculation. Many AM fungi-responsive genes were homologs to MtPt4, STR, STR2, MtFatM, and enriched pathways such as fatty acid biosynthesis, response to phosphate starvation, and nitrogen metabolism are consistent with previous studies. In total, 5941 lncRNAs were identified, of which more than 3000 were new. Of those, 63 lncRNAs were differentially expressed. The putative target genes of differentially expressed lncRNAs (DELs) were mainly related to phosphate ion transmembrane transport, cellular response to potassium ion starvation, and lipid catabolic processes. Regulatory network analysis showed that DELs might be involved in the regulation of bidirectional nutrient exchange between plant and AM fungi as mimicry of microRNA targets. The results of this study can broaden our knowledge on the interaction between plant and AM fungi.


研究背景

玉米是一种全球种植的重要的农作物,广泛应作牲畜饲料,食物以及工业原料;然而自然环境中的生物和非生物胁迫通常限制玉米的产量,比如病虫害和营养缺失;为了应对这些生长的不利因素,大量化肥和农药应用于农作物,无节制的使用造成地下水体污染和土壤板结等;除了化肥之外,土壤中有益的微生物也能够直接或间接的提高作物产量,进一步提高化肥的利用效率。在所有土壤微生物中,丛枝状菌根真菌和根瘤菌能够与植物建立互惠互利的共生关系,其中丛枝状菌根真菌能够与80%以上的陆生植物共生,且将其菌丝吸收的100%磷和80%氮供给宿主植物,反过来获得宿主植物光合作用获得的碳水化合物。随着转录组学在植物-丛枝状菌根真菌共生中的应用,尽管一些具有编码能力的mRNA已经得到广泛研究,但是在许多生物进程中发挥着重要调控作用的长链非编码RNA的功能却少有报道;因此本研究以接种和不接种AM真菌的玉米作为研究对象进行链特异性转录组测序,旨在探索lncRNA在AM真菌与玉米共生中发挥的功能。


实验设计:



研究结果


1. 接种AM真菌后GEGs分析


结果显示,1837个mRNA在接种AM真菌后差异表达,其中1019个mRNA上调表达,818个mRNA下调表达(图1,B);且许多与AM真菌定殖相关marker基因(如 MtPT4, STR, STR2以及MtFatM)同源的基因上调表达,表明RNA-Seq的结果是可靠的。



两组处理中差异表达基因分析


2. DEGs的GO和KEGG富集分析

   

      为了进一步了解接种AM真菌后差异表达的基因主要具有哪些功能,作者对差异表达的mRNA进行富集分析,GO富集分析结果显示,DEGs主要富集在质膜结合小泡以及与衰老相关的囊泡等细胞组分中,ATP结合,DNA结合以及铵跨膜转运体活性相关的分子功能中,以及氧化还原过程,脂肪酸分解代谢和生物合过程,细胞内磷胁迫反应的正调控过程以及铵跨膜转运等生物过程(图2,A-C);KEGG富集分析结果显示,DEGs主要富集在苯丙烷生物合成,氮代谢,脂肪酸合成和磷胁迫响应过程(图2,D),说明AM真菌的侵染,使得参与离子运输和脂肪代谢的基因表达发生了显著变化。

图2响应AM真菌侵染DEGs的GO和KEGG富集分析


3. lncRNAs鉴定


通过链特异性的转录组组测序,不仅获得mRNA的表达情况,还能获得lncRNA的表达情况,作者将测序获得的reads与玉米参考基因组比对,最终将9070条未比对上且长度大于200nt的转录本视为假定的lncRNA,接着再用CPC,CNCI和Pfam三款软件预测上述的假定lncRNA的编码能力,最终获得3000多条新鉴定的lncRNA,且多数lncRNAs的长度小于1000nt(图3)。


3 lncRNAs的鉴定


4. DE lncRNAs的鉴定及靶基因预测

       

         既然这些新鉴定出的lncRNA是AM真菌侵染后表达的,那么它们一定参与植物与AM真菌的共生过程,那么这个lncRNA在其中又发挥着什么功能呢?接着作者设置阈值,获得差异表达的lncRNA,且对它们进行靶基因预测,结果显示这些DELs上下游10kb以内存在266个顺式作用的靶基因,结合作者前期对玉米和AM真菌共生中miRNA的研究,使用RI search软件发现,15个DE miRNA是本研究获得DE lncRNA的靶基因,而516个mRNA是15个miRNA的靶基因,那么本研究DE lncRNA共有778个差异表达的靶基因。


图4 DE lncRNAs的聚类热图


5. DELs靶基因的GO和KEGG富集分析


为了进一步弄清楚这些lncRNA的靶基因具有什么样的功能,作者对这些靶向的mRNA进行富集分析,GO和KEGG富集分析显示,磷酸盐离子跨膜运输和脂肪酸代谢途径在植物和AM真菌共生中发挥着重要作用(图5-6)。

 


5 响应AM真菌侵染DE lncRNAs靶基因的GO富集分析




6响应AM真菌侵染DE lncRNAs靶基因的KEGG富集分析


6. DELs的调控网络

      

        通过Cytoscape软件分析lncRNA-miRNA,miRNA-靶基因,GO-靶基因以及KEGG-靶基因之间的关系,结果显示大多数lncRNA可以通过miRNA调控mRNA,表明lncRNA能够通过miRNA来调控菌根共生中脂质代谢和磷胁迫响应相关基因的表达(图7)。


7响应AM真菌侵染的lncRNAs调控网络图


7. Real-Time PCR验证


         随机选取4个上调表达的DELs和1个响应AM真菌侵染的mRNA进行Real-Time PCR验证,结果显示转录组的数据是可靠的(图8)。基于本文前期研究,miR399和miR397家族部分成员参与脂肪酸代谢和脂质转运过程,而本文鉴定出的一些上调表达的lncRNAs是一些miRNA的靶基因,所以这些lncRNAs可能是调控AM真菌侵染的关键成员。


图8 5个上调DEGs和DELs的real-time PCR验证

 

 

文章亮点

      将mRNA, lncRNA和miRNA的测序结果进行关联分析,阐述lncRNA在植物与AM真菌共生的脂质和磷代谢途径中发挥着重要作用,为菌植互作的研究奠定了理论基础。



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